近日，青島科技大學海洋學院馬翠萍教授團隊在病原體RNA快速檢測、提高核酸檢測特異性領(lǐng)域取得新進展。相關(guān)成果以“Engineering of a chimeric template triggers RNase H-based isothermal amplification approach for sensitive detection of pathogen RNA”和“Boron nitride nanoplate-based improvement of the specificity and sensitivity in loop-mediated isothermal amplification for Vibrio parahaemolyticus detection”為題目分別發(fā)表在國際知名期刊《Analytical Chemistry》（中科院一區(qū)Top）（doi.org/10.1021/acs.analchem.3c04098）和《Analytica Chimica Acta》（中科院一區(qū)Top）（doi.org/10.1016/j.aca.2023.341851）上。論文第一作者分別為海洋學院第五層次引進人才李勇副教授和研究生張鑫，以及研究生藺碩，兩項成果通訊作者均為馬翠萍教授，青島科技大學為第一單位和唯一通訊單位。
病原體的準確檢測對于臨床診斷和生物醫(yī)學研究具有重大的意義，基于DNA檢測聚合酶鏈式反應(yīng)（Polymerase chain reaction, PCR）技術(shù)作為病原體檢測的金標準，具有高靈敏、高特異性的優(yōu)點，但存在無法區(qū)分病原體生存狀態(tài)的問題；相比之下，RNA具有半衰期短、豐度高的特點，基于RNA的檢測可以選擇性地檢出具有轉(zhuǎn)錄活性的病原體。針對病原菌的高靈敏、快速檢測問題，馬翠萍教授團隊構(gòu)建出一種新型等溫RNA檢測技術(shù)，該技術(shù)基于DNA/RNA嵌合探針觸發(fā)指數(shù)擴增反應(yīng)，檢測結(jié)果可以通過便攜式紫外燈即可進行判讀，且無需精密的溫度控制裝置（圖1）。另外，該技術(shù)可以實現(xiàn)靶標RNA區(qū)域的短期保護，即使在RNA酶存在的條件下，該技術(shù)至少可以保證36小時內(nèi)RNA不會發(fā)生降解，避免了由于靶標降解造成的假陰性問題。該平臺對于大腸桿菌RNA的檢測限為1 fg/μL, 對于牛奶中大腸桿菌的檢測限為1.0×102 CFU/mL，檢測過程40分鐘之內(nèi)即可完成，不依賴于復雜的檢測設(shè)備，有望成為臨床診斷和食品安全檢測領(lǐng)域強有力的RNA檢測工具。
圖1 基于RNase H的等溫指數(shù)擴增方法示意圖
此外，以DNA擴增為基礎(chǔ)的核酸檢測已廣泛用于分子診斷、食品安全監(jiān)測和傳染病預(yù)防。然而，引物二聚體的形成、發(fā)夾結(jié)構(gòu)和錯配雜交導致的非特異性擴增嚴重限制核酸檢測技術(shù)的實際應(yīng)用。因此，迫切需要探索一種提高核酸檢測的特異性和靈敏度的方法。馬翠萍教授團隊證明了納米材料氮化硼納米片（Boron Nitride Nanoplate, BNNP)，由于其獨特的表面性質(zhì)，可以與擴增反應(yīng)的主要組分，如單鏈引物和Bst DNA聚合酶相互作用，并提高溶液的導熱性，BNNP的存在顯著提高了PCR和環(huán)介導等溫擴增（Loop-mediated isothermal Amplification, LAMP）的特異性（圖2）。此外，BNNP還提高了LAMP的靈敏度，并且基于BNNP的LAMP的檢出限比傳統(tǒng)LAMP低兩個數(shù)量級，同時此方法被證實可用于海產(chǎn)品中副溶血性弧菌的檢測。這是首次系統(tǒng)地證明BNNP可以提高PCR和LAMP擴增反應(yīng)的效率和準確度，從而極大地擴展了核酸檢測在實驗室和現(xiàn)場環(huán)境中的應(yīng)用。
圖2 BNNP提高核酸擴增方法特異性和靈敏度的原理圖
